En 1936, le professeur d'archéologie, Henry Walton Jones Jr dit « Indiana », parcourt le monde à la recherche de trésors dont il fait don à son université. De retour d'Amérique du Sud où son principal concurrent, le Français Belloq, lui a dérobé de façon déloyale une idole en or massif, Jones est mandaté par les services secrets américains pour court-circuiter les agents du IIIe Reich qui pensent avoir localisé l'Arche d'alliance, contenant les Tables de la Loi, sur le site de Tanis en Égypte. Celle-ci étant censée conférer le pouvoir de mener n'importe quelle armée à la victoire, elle ne doit en aucun cas tomber entre les mains d'Adolf Hitler. Indiana s'envole pour le Népal où réside Marion Ravenwood, fille d'un de ses anciens professeurs et son premier amour. Cette dernière est en effet en possession du Médaillon de Râ, un artefact qui permettrait selon la légende de localiser précisément la relique sainte. Mais les nazis, secondés par Belloq, ont une longueur d'avance...